【知識(shí)庫(kù)】如何做到蛋白質(zhì)電泳遷移率的精確可重復(fù)性測(cè)量？

開(kāi)發(fā)基于蛋白質(zhì)的產(chǎn)品需要了解它們?cè)谌芤褐械谋憩F(xiàn)，而測(cè)量樣品的Zeta電位可通過(guò)預(yù)測(cè)聚集行為，研究蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性。但在實(shí)際測(cè)量過(guò)程中，Zeta電位明顯變化并不是電場(chǎng)本身導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的聚集，其變化的真正原因是蛋白質(zhì)與電極的接觸導(dǎo)致。

本文將介紹一種新的方法：擴(kuò)散屏障法，可以提高測(cè)量樣品Zeta電位時(shí)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

擴(kuò)散屏障法通過(guò)引入一個(gè)較小的樣品量，用溶解蛋白質(zhì)的相同緩沖液將樣品與電極分離，因此電極對(duì)蛋白質(zhì)的影響大大降低。由于這種保護(hù)僅由樣品與電極的距離提供，在樣品擴(kuò)散到電極之前，樣品都不會(huì)受其影響。而這一過(guò)程可能需要數(shù)小時(shí)，因?yàn)橹粶y(cè)量了可溶性天然蛋白的遷移率，使得樣品的測(cè)量結(jié)果更加可靠。

一、樣品裝載

首先將溶解蛋白質(zhì)的緩沖液注入折疊毛細(xì)管樣品池中。然后將樣品池放入Zetasizer納米粒度電位儀中靜置2至3分鐘，使其溫度達(dá)到平衡。這將減少任何與溫度有關(guān)的流體運(yùn)動(dòng)，如對(duì)流。然后取出樣品池，通過(guò)圖1所示的槍頭將20~100 μL的樣品直接注入毛細(xì)管樣品池的最底部（圖2）。

圖 1 200μl的凝膠上樣移液槍頭

圖2 折疊毛細(xì)管孔中的凝膠移液槍頭，用于裝載擴(kuò)散屏障方法的樣品量

圖3 裝樣對(duì)比圖：在10 mM NaCl中充滿藍(lán)色葡聚糖的樣品池（左）；樣品池填充10 mM NaCl，并加入50 μl藍(lán)色葡聚糖作為擴(kuò)散屏障（右）

很明顯，樣品的藍(lán)色部分位于樣品池的測(cè)量體積中，距離樣品池頂部的電極有相當(dāng)大的距離。如果樣品池保持直立并小心處理，樣品將不會(huì)在樣品池內(nèi)部擴(kuò)散。在開(kāi)始測(cè)量之前，應(yīng)使溫度達(dá)到平衡。

二、遷移率測(cè)量

理論上，使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行遷移率測(cè)量與在Zetasizer Nano中進(jìn)行常規(guī)測(cè)量相同。在實(shí)際測(cè)樣過(guò)程中，離子強(qiáng)度較高的緩沖液會(huì)有較高的電導(dǎo)率，導(dǎo)致在給定電壓下焦耳加熱增加。需要進(jìn)行一些手動(dòng)改進(jìn)，以提高使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行測(cè)量的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

為了避免顯著的焦耳熱，應(yīng)根據(jù)所使用的緩沖液的導(dǎo)電性來(lái)選擇電壓。如表1所示，在軟件中自動(dòng)選擇適當(dāng)?shù)碾妷海S著緩沖鹽的濃度增加，所用的電壓降低，并且運(yùn)行次數(shù)最多為20次，以盡量減少焦耳熱。建議在兩次測(cè)量之間設(shè)置180秒的延遲，這也是為了確保測(cè)量之間的溫度平衡。

表1：給定濃度緩沖液的建議電壓和最大運(yùn)行次數(shù)

Zetasizer軟件版本7及以上的蛋白質(zhì)遷移率測(cè)量類型將使所有這些設(shè)置自動(dòng)化，使測(cè)量盡可能簡(jiǎn)單。

一，粒徑分布變化

建議在zeta電位測(cè)量之前和之后都進(jìn)行粒徑測(cè)量，以檢查樣品是否因電位測(cè)量而發(fā)生變化。如果遷移率測(cè)量影響了樣品并導(dǎo)致其聚集，這些聚集應(yīng)該出現(xiàn)在遷移率測(cè)量后的尺寸測(cè)量數(shù)據(jù)中。圖4A顯示了在任何遷移率測(cè)量之前的粒徑測(cè)量示例。該樣本不含聚集體，PDI為0.05。在常規(guī)的zeta電位測(cè)量后，聚集體已經(jīng)形成，PDI接近0.2（圖4B）。然而，當(dāng)采用擴(kuò)散屏障法時(shí)，沒(méi)有形成聚集體，遷移率測(cè)量后的PDI仍然低于0.05（圖4C）。

圖4A 樣品遷移率測(cè)量前的粒徑分布

圖4B 樣品常規(guī)遷移率測(cè)量后的粒徑分布

圖4C 使用擴(kuò)散屏障法測(cè)量遷移率后的粒徑分布

二、頻率分布的對(duì)比

樣品中的聚集體將具有較低的布朗運(yùn)動(dòng)速度，從而在頻率圖中產(chǎn)生一個(gè)尖銳的峰值。因此，頻率圖中出現(xiàn)寬峰是識(shí)別高質(zhì)量數(shù)據(jù)的好方法。

圖5顯示了蛋白質(zhì)遷移率測(cè)量的兩個(gè)頻率圖。圖5A顯示了使用擴(kuò)散屏障法重復(fù)測(cè)量的頻率寬峰，連續(xù)測(cè)量的圖重疊良好，表明沒(méi)有聚集物存在。圖5B顯示了未使用擴(kuò)散屏障法的連續(xù)測(cè)量疊加圖。第一個(gè)測(cè)量是紅線，它顯示了廣泛的分布和良好的測(cè)量。然而，隨著測(cè)量的進(jìn)行，由綠藍(lán)線和黑線表示，很明顯，一個(gè)大而尖銳的峰正在形成，這代表了在測(cè)量過(guò)程中聚集的樣品。多次測(cè)量的圖不一致，因此無(wú)法獲得可重復(fù)的遷移率測(cè)量。

圖5A 使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行的連續(xù)測(cè)量的頻率圖

圖5B：常規(guī)遷移率測(cè)量的頻率圖

焦耳熱是測(cè)量重復(fù)性下降的原因之一，而通過(guò)電導(dǎo)率的測(cè)量可以有效識(shí)別焦耳熱。為了盡量減少焦耳熱的影響，電導(dǎo)率應(yīng)限制在連續(xù)測(cè)量之間的增加不超過(guò)5-10%。如果它的增加超過(guò)這個(gè)值，則表明已經(jīng)發(fā)生了明顯的加熱，這可能會(huì)影響樣品并降低測(cè)量的可重復(fù)性。

至少要進(jìn)行5次測(cè)量，以確保數(shù)據(jù)是可重復(fù)的。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，建議測(cè)試一種廉價(jià)的替代蛋白質(zhì)，以優(yōu)化方法。